JavaScript este în prezent dezactivat în browserul dvs.Când javascript este dezactivat, unele funcții ale acestui site web nu vor funcționa.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Departamentul de Știință, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, Spania * Acești autori au câteva perspective asupra acestei lucrări Equal Fondul contribuției: Acidul hialuronic (HA) este o polizaharidă naturală utilizată în producția de umpluturi dermice în scopuri estetice.Deoarece are un timp de înjumătățire de câteva zile în țesuturile umane, umpluturile dermice pe bază de HA sunt modificate chimic pentru a-și prelungi viața în organism.Cea mai comună modificare a materialelor de umplutură comerciale pe bază de HA este utilizarea 1,4-butandiol diglicidil eter (BDDE) ca agent de reticulare pentru reticulare a lanțurilor de HA.BDDE rezidual sau nereacționat este considerat netoxic la <2 părți per milion (ppm);prin urmare, BDDE rezidual din materialul de umplere cutanat final trebuie cuantificat pentru a asigura siguranța pacientului.Materiale și metode: Acest studiu descrie detectarea și caracterizarea unui produs secundar al reacției de reticulare dintre BDDE și HA în condiții alcaline prin combinarea cromatografiei lichide și spectrometriei de masă (LC-MS).Rezultate: După diferite analize, s-a constatat că condițiile alcaline și temperatura ridicată utilizate pentru dezinfectarea hidrogelului HA-BDDE au favorizat formarea acestui nou produs secundar, compusul „asemănător propilenglicolului”.Analiza LC-MS a confirmat că produsul secundar are aceeași masă monoizotopică ca BDDE, un timp de retenție diferit (tR) și un mod diferit de absorbție UV (λ=200 nm).Spre deosebire de BDDE, s-a observat în analiza LC-MS că, în aceleași condiții de măsurare, acest produs secundar are o rată de detecție mai mare la 200 nm.Concluzie: Aceste rezultate indică faptul că nu există epoxid în structura acestui nou compus.Discuția este deschisă pentru a evalua riscul acestui nou produs secundar găsit în producția de hidrogel HA-BDDE (umplutură cutanată HA) în scopuri comerciale.Cuvinte cheie: acid hialuronic, filler dermal HA, acid hialuronic reticulat, BDDE, analiză LC-MS, produs secundar BDDE.
Fillerele pe bază de acid hialuronic (HA) sunt cele mai comune și populare umpluturi dermice utilizate în scopuri cosmetice.1 Acest material de umplutură cutanat este un hidrogel, de obicei compus din >95% apă și 0,5-3% HA, ceea ce le conferă o structură asemănătoare gelului.2 HA este o polizaharidă și componenta principală a matricei extracelulare a vertebratelor.Unul dintre ingrediente.Constă din (1,4)-acid glucuronic-β (1,3)-N-acetilglucozamină (GlcNAc) unități repetate de dizaharidă conectate prin legături glicozidice.Acest model de dizaharide este același în toate organismele.În comparație cu unele substanțe de umplutură pe bază de proteine (cum ar fi colagenul), această proprietate face din HA o moleculă extrem de biocompatibilă.Aceste materiale de umplutură pot prezenta specificitate secvenței de aminoacizi care poate fi recunoscută de sistemul imunitar al pacientului.
Când este utilizat ca umplutură dermică, principala limitare a HA este schimbarea sa rapidă în țesuturi, datorită prezenței unei familii specifice de enzime numite hialuronidaze.Până acum, au fost descrise mai multe modificări chimice în structura HA pentru a crește timpul de înjumătățire al HA în țesuturi.3 Cele mai multe dintre aceste modificări încearcă să reducă accesul hialuronidazei la polimerii polizaharidici prin reticulare a lanțurilor de HA.Prin urmare, datorită formării punților și a legăturilor covalente intermoleculare dintre structura HA și agentul de reticulare, hidrogelul de HA reticulat produce mai mulți produși de degradare anti-enzimă decât HA natural.4-6
Până în prezent, agenții chimici de reticulare utilizați pentru a produce HA reticulat includ metacrilamidă, 7 hidrazidă, 8 carbodiimidă, 9 divinil sulfonă, 1,4-butandiol diglicidil eter (BDDE) și poli(etilen glicol) diglicidil eter.10,11 BDDE este în prezent cel mai frecvent utilizat agent de reticulare.Deși s-a dovedit că aceste tipuri de hidrogeluri sunt sigure de zeci de ani, agenții de reticulare utilizați sunt reactivi reactivi care pot fi citotoxici și, în unele cazuri, mutageni.12 Prin urmare, conținutul lor rezidual în hidrogelul final trebuie să fie ridicat.BDDE este considerat sigur atunci când concentrația reziduală este mai mică de 2 părți per milion (ppm).4
Există mai multe metode pentru a detecta concentrația BDDE cu reziduuri scăzute, gradul de reticulare și poziția de substituție în hidrogelurile HA, cum ar fi cromatografia în gaz, cromatografia de excludere a mărimii cuplată cu spectrometrie de masă (MS), metodele de măsurare a fluorescenței prin rezonanță magnetică nucleară (RMN) și Cromatografie lichidă de înaltă performanță cuplată cu matrice de diode (HPLC).13-17 Acest studiu descrie detectarea și caracterizarea unui produs secundar în hidrogelul final de HA reticulat produs prin reacția BDDE și HA în condiții alcaline.HPLC și cromatografie lichidă-spectrometrie de masă (analiza LC-MS).Deoarece toxicitatea acestui produs secundar al BDDE este necunoscută, recomandăm ca cuantificarea reziduurilor acestuia să fie determinată într-un mod similar cu metoda efectuată de obicei pe BDDE în produsul final.
Sarea de sodiu obținută a HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japonia) are o greutate moleculară de ~1.368.000 Da (metoda Laurent) 18 și o vâscozitate intrinsecă de 2,20 m3/kg.Pentru reacția de reticulare, BDDE (≥95%) a fost achiziționat de la Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, SUA).Soluție salină tamponată cu fosfat cu pH 7,4 a fost achiziționată de la Sigma-Aldrich Company.Toți solvenții, acetonitrilul și apa utilizați în analiza LC-MS au fost achiziționați de la calitate HPLC.Acidul formic (98%) este achiziționat ca reactiv.
Toate experimentele au fost efectuate pe un sistem UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, SUA) și conectate la un spectrometru de masă triplu quadrupol API 3000 echipat cu o sursă de ionizare electrospray (AB SCIEX, Framingham, MA, SUA).
Sinteza hidrogelurilor de HA reticulate a fost începută prin adăugarea a 198 mg de BDDE la o soluție 10% (g/g) de hialuronat de sodiu (NaHA) în prezența a 1% alcalin (hidroxid de sodiu, NaOH).Concentraţia finală de BDDE în amestecul de reacţie a fost de 9,9 mg/mL (0,049 mM).Apoi, amestecul de reacţie a fost bine amestecat şi omogenizat şi lăsat să se desfăşoare la 45°C timp de 4 ore.19 pH-ul reacției este menținut la ~12.
După aceea, amestecul de reacţie a fost spălat cu apă şi hidrogelul final de HA-BDDE a fost filtrat şi diluat cu tampon PBS pentru a obţine o concentraţie de HA de 10 până la 25 mg/mL şi un pH final de 7,4.Pentru a steriliza hidrogelurile de HA reticulate produse, toate aceste hidrogeluri sunt autoclavate (120°C timp de 20 de minute).Hidrogelul BDDE-HA purificat este păstrat la 4°C până la analiză.
Pentru a analiza BDDE prezent în produsul HA reticulat, o probă de 240 mg a fost cântărită și introdusă în orificiul central (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, SUA; volum 0,5 ml) și centrifugata la 10.000 rpm la temperatura camerei 10 minute.A fost colectat și analizat un total de 20 uL de lichid de tragere în jos.
Pentru a analiza standardul BDDE (Sigma-Aldrich Co) în condiții alcaline (1%, 0,1% și 0,01% NaOH), dacă sunt îndeplinite următoarele condiții, proba lichidă este 1:10, 1:100 sau până la 1:1.000.000 Dacă este necesar, utilizați apă deionizată MilliQ pentru analiză.
Pentru materiile prime utilizate în reacția de reticulare (HA 2%, H2O, 1% NaOH și 0,049 mM BDDE), 1 mL din fiecare probă preparată din aceste materiale a fost analizat folosind aceleași condiții de analiză.
Pentru a determina specificitatea vârfurilor care apar în harta ionică, la proba de 20 ui s-au adăugat 10 ui de soluție standard BDDE de 100 ppb (Sigma-Aldrich Co).În acest caz, concentrația finală a standardului în fiecare probă este de 37 ppb.
Mai întâi, pregătiți o soluție stoc BDDE cu o concentrație de 11.000 mg/L (11.000 ppm) prin diluarea a 10 μL de BDDE standard (Sigma-Aldrich Co) cu 990 μL apă MilliQ (densitate 1,1 g/mL).Utilizați această soluție pentru a prepara o soluție BDDE de 110 µg/L (110 ppb) ca diluție standard intermediară.Apoi, utilizați diluantul standard intermediar BDDE (110 ppb) pentru a pregăti curba standard prin diluarea diluantului intermediar de mai multe ori pentru a obține concentrația dorită de 75, 50, 25, 10 și 1 ppb.După cum se arată în Figura 1, se constată că curba standard BDDE de la 1,1 la 110 ppb are o liniaritate bună (R2>0,99).Curba standard a fost repetată în patru experimente independente.
Figura 1 Curba de calibrare standard BDDE obţinută prin analiza LC-MS, în care se observă o corelaţie bună (R2>0,99).
Abrevieri: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, cromatografie lichidă și spectrometrie de masă.
Pentru a identifica și cuantifica standardele BDDE prezente în HA reticulat și standardele BDDE în soluția de bază, a fost utilizată analiza LC-MS.
Separarea cromatografică a fost realizată pe o coloană LUNA 2,5 µm C18(2)-HST (50 x 2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, SUA) și menținută la temperatura camerei (25°C) în timpul analizei.Faza mobilă constă din acetonitril (solvent A) și apă (solvent B) care conține 0,1% acid formic.Faza mobilă este eluată prin eluare în gradient.Gradientul este următorul: 0 minute, 2% A;1 minut, 2% A;6 minute, 98% A;7 minute, 98% A;7,1 minute, 2% A;10 minute, 2% A. Timpul de funcționare este de 10 minute și volumul de injectare este de 20 µL.Timpul de retenție al BDDE este de aproximativ 3,48 minute (variind de la 3,43 la 4,14 minute pe baza experimentelor).Faza mobilă a fost pompată la un debit de 0,25 mL/min pentru analiza LC-MS.
Pentru analiza BDDE și cuantificarea prin MS, sistemul UPLC (Waters) este combinat cu un spectrometru de masă triplu quadrupol API 3000 (AB SCIEX) echipat cu o sursă de ionizare electrospray, iar analiza se realizează în modul ion pozitiv (ESI+).
Conform analizei fragmentului ionic efectuat pe BDDE, fragmentul cu cea mai mare intensitate a fost determinat a fi fragmentul corespunzător la 129,1 Da (Figura 6).Prin urmare, în modul de monitorizare multi-ion (MIM) pentru cuantificare, conversia masei (raportul masă-încărcare [m/z]) a BDDE este 203,3/129,1 Da.De asemenea, utilizează modul de scanare completă (FS) și modul de scanare cu ioni de produs (PIS) pentru analiza LC-MS.
Pentru a verifica specificitatea metodei, a fost analizată o probă martor (fază mobilă inițială).Nu a fost detectat niciun semnal în proba martor cu o conversie de masă de 203,3/129,1 Da.În ceea ce privește repetabilitatea experimentului, au fost analizate 10 injecții standard de 55 ppb (în mijlocul curbei de calibrare), rezultând o abatere standard reziduală (RSD) <5% (datele nu sunt prezentate).
Conținutul rezidual de BDDE a fost cuantificat în opt hidrogeluri HA reticulate BDDE autoclavate diferite, corespunzând la patru experimente independente.După cum este descris în secțiunea „Materiale și metode”, cuantificarea este evaluată prin valoarea medie a curbei de regresie a diluției standard BDDE, care corespunde vârfului unic detectat la tranziția de masă BDDE de 203,3/129,1 Da, cu o retenție. timp de 3,43 până la 4,14 minute Nu aștept.Figura 2 prezintă un exemplu de cromatogramă a standardului de referință BDDE de 10 ppb.Tabelul 1 rezumă conținutul rezidual de BDDE a opt hidrogeluri diferite.Intervalul de valori este de la 1 la 2,46 ppb.Prin urmare, concentrația reziduală de BDDE din probă este acceptabilă pentru uz uman (<2 ppm).
Figura 2 Cromatograma ionică a standardului de referință BDDE de 10 ppb (Sigma-Aldrich Co), tranziție MS (m/z) obținută prin analiza LC-MS de 203,30/129,10 Da (în modul MRM pozitiv).
Abrevieri: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, cromatografie lichidă și spectrometrie de masă;MRM, monitorizarea reacțiilor multiple;MS, masa;m/z, raportul masă-încărcare.
Notă: Probele 1-8 sunt hidrogeluri HA reticulate BDDE autoclavate.Sunt raportate, de asemenea, cantitatea reziduală de BDDE din hidrogel și vârful timpului de retenție al BDDE.În sfârșit, se semnalează și existența unor noi vârfuri cu timpi de retenție diferiți.
Abrevieri: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HA, acid hialuronic;MRM, monitorizarea reacțiilor multiple;tR, timp de retenție;LC-MS, cromatografie lichidă și spectrometrie de masă;RRT, timp relativ de retenție.
În mod surprinzător, analiza cromatogramei ionice LC-MS a arătat că pe baza tuturor probelor de hidrogel HA reticulate autoclavate analizate, a existat un vârf suplimentar la timpul de retenție mai scurt de 2,73 până la 3,29 minute.De exemplu, Figura 3 prezintă cromatograma ionică a unei probe de HA reticulat, unde un vârf suplimentar apare la un timp de retenție diferit de aproximativ 2,71 minute.Timpul de retenție relativ (RRT) observat între vârful nou observat și vârful de la BDDE a fost de 0,79 (Tabelul 1).Deoarece știm că vârful nou observat este mai puțin reținut în coloana C18 utilizată în analiza LC-MS, noul vârf poate corespunde unui compus mai polar decât BDDE.
Figura 3 Cromatograma ionică a probei de hidrogel HA reticulat obţinută prin LC-MS (conversie de masă MRM 203,3/129,0 Da).
Abrevieri: HA, acid hialuronic;LC-MS, cromatografie lichidă și spectrometrie de masă;MRM, monitorizarea reacțiilor multiple;RRT, timp relativ de retenție;tR, timp de retenție.
Pentru a exclude posibilitatea ca noile vârfuri observate să fie contaminanți prezenți inițial în materiile prime utilizate, aceste materii prime au fost de asemenea analizate folosind aceeași metodă de analiză LC-MS.Materiile prime analizate includ apă, 2% NaHA în apă, 1% NaOH în apă și BDDE la aceeași concentrație utilizată în reacția de reticulare.Cromatograma ionică a materiei prime utilizate nu a prezentat niciun compus sau vârf, iar timpul de retenție al acestuia corespunde noului vârf observat.Acest fapt înlătură ideea că nu numai materia primă poate conține orice compuși sau substanțe care pot interfera cu procedura de analiză, dar nu există niciun semn de posibilă contaminare încrucișată cu alte produse de laborator.Valorile concentrației obținute după analiza LC-MS a BDDE și a noilor vârfuri sunt prezentate în Tabelul 2 (probele 1-4) și cromatograma ionică în Figura 4.
Notă: Probele 1-4 corespund materiilor prime utilizate pentru a produce hidrogeluri HA reticulate BDDE autoclavate.Aceste mostre nu au fost autoclavate.
Abrevieri: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HA, acid hialuronic;LC-MS, cromatografie lichidă și spectrometrie de masă;MRM, monitorizare cu reacții multiple.
Figura 4 corespunde cromatogramei LC-MS a unei probe din materia primă utilizată în reacția de reticulare a HA și BDDE.
Notă: Toate acestea sunt măsurate la aceeași concentrație și raport utilizat pentru a efectua reacția de reticulare.Numerele materiilor prime analizate prin cromatogramă corespund: (1) apă, (2) soluție apoasă 2% HA, (3) soluție apoasă 1% NaOH.Analiza LC-MS este efectuată pentru conversia de masă de 203,30/129,10 Da (în modul MRM pozitiv).
Abrevieri: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HA, acid hialuronic;LC-MS, cromatografie lichidă și spectrometrie de masă;MRM, monitorizare cu reacții multiple.
Au fost studiate condițiile care au dus la formarea de noi vârfuri.Pentru a studia modul în care condițiile de reacție utilizate pentru producerea hidrogelului de HA reticulat afectează reactivitatea agentului de reticulare BDDE, conducând la formarea de noi vârfuri (posibili subproduși), au fost efectuate diferite măsurători.În aceste determinări, am studiat și analizat agentul de reticulare BDDE final, care a fost tratat cu diferite concentrații de NaOH (0%, 1%, 0,1% și 0,01%) într-un mediu apos, urmat de sau fără autoclavare.Procedura bacteriilor pentru a simula aceleași condiții este aceeași cu metoda utilizată pentru a produce hidrogelul HA reticulat.După cum este descris în secțiunea „Materiale și metode”, tranziția de masă a probei a fost analizată prin LC-MS la 203,30/129,10 Da.Se calculează BDDE și concentrația noului vârf, iar rezultatele sunt prezentate în Tabelul 3. Nu au fost detectate noi vârfuri în probele care nu au fost autoclavate, indiferent de prezența NaOH în soluție (probele 1-4, Tabelul). 3).Pentru probele autoclavate, noi vârfuri sunt detectate doar în prezența NaOH în soluție, iar formarea vârfului pare să depindă de concentrația de NaOH din soluție (probele 5-8, Tabelul 3) (RRT = 0,79).Figura 5 prezintă un exemplu de cromatogramă ionică, prezentând două probe autoclavate în prezența sau absența NAOH.
Abrevieri: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, cromatografie lichidă și spectrometrie de masă;MRM, monitorizare cu reacții multiple.
Notă: Cromatograma de sus: Proba a fost tratată cu soluție apoasă de NaOH 0,1% și autoclavată (120°C timp de 20 de minute).Cromatograma de jos: Proba nu a fost tratată cu NaOH, ci autoclavată în aceleași condiții.Conversia de masă de 203,30/129,10 Da (în modul MRM pozitiv) a fost analizată prin LC-MS.
Abrevieri: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, cromatografie lichidă și spectrometrie de masă;MRM, monitorizare cu reacții multiple.
În toate probele autoclavate, cu sau fără NaOH, concentrația de BDDE a fost mult redusă (de până la 16,6 ori) (probele 5-8, Tabelul 2).Scăderea concentrației de BDDE se poate datora faptului că, la temperaturi ridicate, apa poate acționa ca bază (nucleofilă) pentru a deschide inelul epoxid al BDDE pentru a forma un compus 1,2-diol.Calitatea monoizotopică a acestui compus este diferită de cea a BDDE și, prin urmare, nu va fi afectată.LC-MS a detectat o schimbare de masă de 203,30/129,10 Da.
În cele din urmă, aceste experimente arată că generarea de noi vârfuri depinde de prezența BDDE, NAOH și de procesul de autoclavare, dar nu are nimic de-a face cu HA.
Noul vârf găsit la un timp de retenție de aproximativ 2,71 minute a fost apoi caracterizat prin LC-MS.În acest scop, BDDE (9,9 mg/mL) a fost incubat într-o soluție apoasă de NaOH 1% și autoclavat.În Tabelul 4, caracteristicile noului vârf sunt comparate cu vârful de referință BDDE cunoscut (timp de retenție aproximativ 3,47 minute).Pe baza analizei fragmentării ionice a celor două vârfuri, se poate concluziona că vârful cu un timp de retenție de 2,72 minute prezintă aceleași fragmente ca și vârful BDDE, dar cu intensități diferite (Figura 6).Pentru vârful corespunzător timpului de retenție (PIS) de 2,72 minute, s-a observat un vârf mai intens după fragmentare la o masă de 147 Da.La concentrația de BDDE (9,9 mg/mL) utilizată în această determinare, s-au observat și diferite moduri de absorbție (UV, λ=200 nm) în spectrul ultraviolet după separarea cromatografică (Figura 7).Vârful cu un timp de retenție de 2,71 minute este încă vizibil la 200 nm, în timp ce vârful BDDE nu poate fi observat în cromatogramă în aceleași condiții.
Tabelul 4 Rezultatele caracterizării noului vârf cu un timp de retenție de aproximativ 2,71 minute și a vârfului BDDE cu un timp de retenție de 3,47 minute
Notă: Pentru a obține aceste rezultate, analizele LC-MS și HPLC (MRM și PIS) au fost efectuate pe cele două vârfuri.Pentru analiza HPLC, se utilizează detecția UV cu o lungime de undă de 200 nm.
Abrevieri: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;HPLC, cromatografie lichidă de înaltă performanță;LC-MS, cromatografie lichidă și spectrometrie de masă;MRM, monitorizarea reacțiilor multiple;m/z, raportul masă-încărcare;PIS, produs Scanare ionică;lumină ultravioletă, lumină ultravioletă.
Notă: Fragmentele de masă sunt obținute prin analiză LC-MS (PIS).Cromatograma de sus: spectrul de masă al fragmentelor de probă standard BDDE.Cromatograma de jos: spectrul de masă al noului vârf detectat (RRT asociat cu vârful BDDE este 0,79).BDDE a fost procesat în soluție de NaOH 1% și autoclavat.
Abrevieri: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil eter;LC-MS, cromatografie lichidă și spectrometrie de masă;MRM, monitorizarea reacțiilor multiple;PIS, scanare ionică de produs;RRT, timp relativ de retenție.
Figura 7 Cromatograma ionică a ionului precursor de 203,30 Da și (A) noul vârf cu un timp de retenție de 2,71 minute și (B) detectarea UV a vârfului standard de referință BDDE la 3,46 minute la 200 nm.
În toate hidrogelurile de HA reticulate produse, s-a observat că concentrația reziduală de BDDE după cuantificarea LC-MS a fost <2 ppm, dar a apărut un nou vârf necunoscut în analiză.Acest nou vârf nu se potrivește cu produsul standard BDDE.Produsul standard BDDE a suferit, de asemenea, aceeași analiză de conversie de calitate (conversie MRM 203,30/129,10 Da) în modul MRM pozitiv.În general, alte metode analitice, cum ar fi cromatografia, sunt utilizate ca teste limită pentru a detecta BDDE în hidrogeluri, dar limita maximă de detecție (LOD) este puțin mai mică de 2 ppm.Pe de altă parte, până acum, RMN și MS au fost utilizate pentru a caracteriza gradul de reticulare și/sau modificare a HA în fragmentele de unități de zahăr ale produselor HA reticulate.Scopul acestor tehnici nu a fost niciodată acela de a cuantifica detectarea BDDE reziduală la concentrații atât de mici așa cum le descriem în acest articol (LOD a metodei noastre LC-MS = 10 ppb).
Ora postării: 01-sept-2021